Om prosjektet

• Bakgrunn

  Norge er verdens største produsent av atlantisk laks og en pådriver for global akvakulturteknologi. I dag er lakseproduksjon Norges nest største eksportvare, og landet ønsker å øke lakseproduksjonen fra ca. 2 millioner tonn per år til 5 millioner tonn innen 2050. For å sikre en bærekraftig vekst i denne sektoren er det flere utfordringer som må løses.

  En av disse er at laksen utsettes for en rekke stressfaktorer i løpet av produksjonssyklusen, som høye vanntemperaturer, lave oksygennivåer, ubalansert ernæringsrelaterte helseproblemer, utbrudd av patogener og håndtering i forbindelse med lakselusbehandling og utsett i sjøvann.

  Alt dette kan føre til dårlig tilvekst, store tap som følge av fiskedødelighet og dårlig lønnsomhet. For å bidra til å løse disse problemene bruker Resilient salmon-prosjektet en immunernæringstilnærming der laksen fôres med nye funksjonelle, helsefremmende fôrtyper etter et spesifikt ernæringsprogram for å oppnå målrettede immunresponser, for eksempel trent immunitet.

• Mål

  Prosjektet handler om å utvikle en mer robust laks som er bedre rustet til å håndtere multi-stressfaktorer ved hjelp av funksjonelt fôr kombinert med ernæringsprogrammering for å stimulere til trent immunitet.

• Forskningen

  Resilient salmon-prosjektet er et spin-off-prosjekt til Foods of Norway, et senter for forskningsdrevet innovasjon, der vi utvikler bioaktive komponenter fra mikrobielle råvarer (f.eks. gjær eller trådsopp) eller ekstrakter fra brunalger som fukoidan til bruk i funksjonelle fôr.

  Disse evalueres i prosjektet med sikte på å forbedre laksens helse og robusthet under den stressfylte perioder ved utsett i sjøvann.

  

  Figur 1. Arbeidsflyt for RESILIENT SALMON

  
  In vitro-screening (WP1) og målrettet levering (WP2) av bioaktive komponenter valgt i WP1. In vivo-studier (WP3) av A) interaksjoner mellom dietter og fiskefamiliegrupper med ulik robusthet i ferskvann og sjøvann (WP3.1), B) ernæringsprogrammering for forbedret immunitet (WP3.2). Evaluering av det mest lovende behandlings- og ernæringsprogrammet i et infeksjonsforsøk (WP4).

  Prøver samlet inn fra WP3-forsøkene vil bli gjenstand for et bredt spekter av vertsfenotyping (histopatologi, immunofenotyping, transkriptomikk, proteomikk) og (WP5) metabolomikk samt metagenomikk og metaproteomikk av tarmmikrobiota vil bli utført for å avdekke faktorer som bestemmer ernæringseffekter på laksens utviklingsbiologi, miljøkrav og mestringsstrategier i de ulike livsstadiene.

  I WP6 vil resultatene bli formidlet og kommunisert til akademia, industrien og samfunnet for å forbedre helsen og robustheten til atlantisk laks.

• Resultater

  In vitro screening

  For å velge ut de mest lovende bioaktive komponentene til lakseforsøkene screener vi først ulike mikrobielle råvarer, tilsetningsstoffer og tareekstrakter (utviklet i Foods of Norway eller av Lallemand AS) i cellelinjer eller primærceller fra laksefisk for å bestemme potensielle immunstimulerende egenskaper. Basert på in vitro-data valgte vi ut to lovende gjærprodukter fra Debaryomyces hansenii gjær og fucoidan-ekstrakt fra sukkertare i en serie forsøk med atlantisk laks.

  De nye gjærproduktene fra D. hansenii stammer enten fra marint opphav (LAN 4) eller fra meieriprodukter (LAN 6), og de er forskjellige med hensyn til innhold og struktur av celleveggbestanddeler (f.eks. α-glukaner, β-glukaner og mannaner). Det mest lovende fucoidanproduktet ble valgt ut på grunnlag av dets evne til å modulere immunrelaterte biomarkører i hodenyreceller fra atlantisk laks. Fucoidaner er komplekse, fuksoserike, sulfaterte, vannløselige polysakkarider med mange bioaktive egenskaper, blant annet immunmodulerende, antivirale, antibakterielle og antioksidante egenskaper, som alle er svært relevante for akvakultur.

  Forsøk med laks

  For å evaluere de funksjonelle stressresponsene hos laks utviklet vi en kortvarig stressmodell med hypoksi, der vi identifiserte flere biomarkører som vi brukte som mål i de følgende studiene. Metoden gikk ut på å eksponere fisken for lite oksygen i 60 sekunder, etterfulgt av plasma- og vevsprøver over en 24-timers periode for å evaluere fysiologiske og immunologiske stressresponser. Vi målte nivået av stresshormonet kortisol i plasma, kombinert med molekylære metoder for å påvise biomarkører både på genuttrykks- og proteinproduksjonsnivå. Resultatene tyder på at akutt-stress-modellen er egnet til å evaluere effekten av funksjonelt fôr på kortvarig stressrespons hos laks, for eksempel under vaksinering eller behandling mot lakselus.

  Forsøk 1: Et forsøk ble utført for å evaluere effekten av funksjonelle fôr som inneholder de to D. hansenii-produktene på fiskens helse og robusthet under sjøvannsoverføring. Fisken ble fôret med enten et kommersielt kontrollfôr eller testfôr som inneholdt et lavt nivå av LAN 4 eller 6 i syv uker i ferskvann, etterfulgt av sjøvannsoverføring og seks uker i sjøvann. All fisk ble vaksinert med en standardvaksine før forsøket startet, som inneholdt antigener mot Moritella viscosa, et bakterielt patogen som fører til vintersår.

  På slutten av ferskvannsfasen ble utvalgte fisk utsatt for kortvarig hypoksi-stress. Resultatene viste at LAN 4 forhindret utskillelse av stresshormonet kortisol etter hypoksi-stress i plasma.  Fra genuttrykk observerte vi at LAN 4 forhindret immunsuppresjon ved å nedregulere utskillelsen av den antiinflammatoriske markøren cytokin IL 10 i plasma og at LAN 4 regulerer ruter relatert til stresstoleranse og oksidativ regulering i gjeller. Ved hjelp av immunhistokjemi fant vi også at dette fôret førte til økt størrelse på begercellene med høyere mucinnivå i den distale tarmen, noe som indikerer mucinlagring, som kan forhindre lokale stressresponser.

  På slutten av ferskvannsfasen ble utvalgte fisk utsatt for kortvarig hypoksi-stress. I sjøvannsfasen hadde vi et naturlig utbrudd av M. viscosa. Interessant nok viste resultatene at vaksinert fisk som var fôret med D. hansenii-gjær LAN 6, hadde økt nivå av spesifikt IgM mot dette patogenet, noe som indikerer at LAN 6 kan forbedre effekten av vaksinen. Basert på genuttrykk tyder resultatene også på at LAN 6 kan føre til økt humoral medfødt immunitet ved å aktivere komplementsystemet i leveren.

  Samlet sett (fig. 2) tyder resultatene på at funksjonelt fôr med begge gjærstammene førte til en mer robust laks, men at immunresponsen var forskjellig: LAN 4 var mer effektiv i å regulere kortsiktige stressresponser, mens LAN6 var mer aktiv i å koordinere immunresponsen mot et patogen etter sjøvannsoverføring. Forskjellene i virkemåte kan ha sammenheng med forskjellene i innhold og struktur i de to D. hansenii-gjærstammene.

  

  Forsøk 2. Et forsøk ble utført for å evaluere effekten av funksjonelt fôr som inneholder brunalgeekstraktet fukoidan hos atlantisk laks i ferskvann. Fisken ble fôret med et kontrollfôr og et funksjonelt fôr som enten inneholdt økende nivåer av fukoidan eller et kommersielt gjærbasert β-glukan. Etter at forsøket var avsluttet, ble hodenyreceller isolert fra laks som hadde fått enten kontrollfôr eller funksjonelt fôr med fucoidan, og stimulert med et inaktivert patogen, Aeromonas salmonicida. Resultatene viste at et høyt innhold av fukoidan resulterte i immundemping, mens et moderat fukoidannivå førte til en økning i proinflammatoriske cytokiner, noe som innebar en tidlig immunaktivering og økt beskyttelse mot stress, noe som ble indikert ved økt produksjon av chaperon.

  På in vivo-nivå fant vi at fukoidan (moderat nivå) aktiverte responser relatert til adaptiv immunitet i den distale tarmen, inkludert utvikling og modulering av T-celler og aktivering av profesjonelle antigenpresenterende celler, noe som tyder på T-cellepolarisering siden vi også påviste en oppregulering av gata3, en global transkripsjonsfaktor relatert til T-hjelper 2-celler (Th2). Ved hjelp av 16 s rRNA-sekvensering fant vi også at fukoidan a fører til endringer i tarmfloraen, med en doseavhengig økning i Bacillus spp, som er kjent for å ha positive helseeffekter.

  Disse resultatene (fig. 3) tyder på at fukoidan er en lovende kandidat for funksjonelt fôr til laks, og at det fungerer enda bedre enn det kommersielt tilgjengelige β-glukanproduktet. Effektiviteten til fukoidan avhenger imidlertid av prosesseringsmetoden som brukes under tangekstraksjonen og doseringen som brukes i fôret.

  

  Forsøk 3. I et oppfølgingsforsøk evaluerte vi om funksjonelt fôr som inneholdt fukoidan og bruk av ernæringsprogrammering kunne føre til opplært immunitet og styrke immunforsvaret til laks når den ble utsatt for en inaktivert patogen utfordring med Tenacibaculum maritimum i sjøvann.

  De foreløpige dataene viste at ett av regimene som ble brukt, var i stand til å modulere denne typen respons i fisken (relatert til cytokiner), og at tilskudd av fukoidan var i stand til å øke den humorale responsen ved å øke antimikrobielle peptider i hodenyrene og tarmen. Resultatene viste også at fisk som ble fôret med fukoidan, hadde høyere fôrinntak, vokste raskere og var mer effektiv enn fisk som ble fôret med kontrollfôr.

  Forsøk 4. For å evaluere helseeffekten av fucoidan i funksjonelle fôr, gjennomførte vi et forsøk med levende patogener i Chile med samme fôrtype og ernæringsprogram som i forsøk 3. I dette forsøket undersøkte vi overlevelse og immunmodulerende responser hos atlantisk laks som ble utfordret med patogenet Tenacibaculum dicentrarchi. Foreløpige resultater viste at dødeligheten var lavere hos laks som ble fôret med det funksjonelle fôret som inneholdt fukoidan. Vi er i gang med å evaluere de mulige immunologiske mekanismene som er involvert i denne responsen på cellenivå og molekylært nivå.

  Totalt sett tyder resultatene på at fukoidan kan være lovende i funksjonelle fôr med sikte på å forbedre helse og robusthet hos atlantisk laks.

• Referanser

  1. Morales-Lange B, et al. 2024. Immunomodulatory effects of hydrolyzed Debaryomyces hansenii in Atlantic salmon (Salmo salar L): From the in vitro model to a natural pathogen challenge after seawater transfer. Aquaculture, 578: 740035.
  2. Michalak L, et al. 2023. Impact of biorefinery processing conditions on the bioactive properties of fucoidan extracts from Saccharina latissima on SHK-1 cells. Algal Research, 75: 103221
  3. Morales-Lange B, et al. 2022. Dietary Inclusion of Hydrolyzed Debaryomyces hansenii Yeasts Modulates Physiological Responses in Plasma and Immune Organs of Atlantic Salmon (Salmo salar) Parr Exposed to Acute Hypoxia Stress. Frontiers in Physiology, 13:83681.
  4. Djordjevic B, et al. 2021. Comparison of Circulating Markers and Mucosal Immune Parameters from Skin and Distal Intestine of Atlantic salmon in Two Models of Acute Stress. Int. J. Mol. Sci., 22: 1028.
  5. Morales-Lange B, et al. 2022. Dietary inclusion of fucoidan from Sugar kelp (Saccharina latissima) modulates immune responses in distal intestine of Atlantic salmon (Salmo salar) pre-smolt. 2nd International Symposium Mucosal Health in Aquaculture. October 3-6, 2022. Madrid, Spain.
  6. Morales-Lange B, et al. 2023. Nutritional programming using Fucoidan from Sugar kelp as a feed additive to improve Trained Immunity in Atlantic salmon against Tenacibaculum maritimum. Aquaculture Europe. September 18 - 21, 2023. Vienna, Austria.
  7. Øverland M., et al, 2022. Role of functional aquafeeds on mucosal immunity: from bioactive compounds to a resilient salmon. 2nd International Symposium Mucosal Health in Aquaculture 2022, Madrid, October 3-6, 2022

Deltakere

Partnere

Akademiske partnere: Prof. Charles Press, Faculty of Veterinary Sciences, Dr. Jake Olsen, University of Wisconsin, Prof. Mónica Imarai, University of Santiago, Chile, Prof. Luis Marcado, Pontifical Catholic University of Valparaíso, Chile.

Industripartnere: Lallemand, AquaGene, Biomar, Borregaard, Seaweed solution.