Fride Berg Standerholen har i denne doktorgraden har hatt som mål å gjøre en nærmere vurdering av flowcytometri som metode for å studere oksespermiers funksjonalitet sett i sammenheng med sædprosesseringsmetode og fertilitetsdata etter kunstig sædoverføring.
Resultatene i doktorgraden til Fride Berg Standerholen viser at det er viktig å være klar over hvordan spermiepopulasjonen defineres i sædkvalitetsanalyse med bruk av flowcytometri for å få pålitelige data. Konvensjonell Biladyl (B) prossessert oksesæd ble sammenliknet med sæd immobilisert i alginat med SpermVital (SV) teknologi og sammenlikning av sædkvalitet etter prosessering viste forskjeller. Sædkvalitetsparametre, slik som plasmamembran- og akrosom-integritet, som anses som viktig for selve befruktningen, var imidlertid ikke korrelert med fruktbarhetsdata.
Viktig for å bedre teknologien og øke muligheten for befruktning
Sædkvalitet er viktig for befruktning og flowcytometri er en teknologi som kan benyttes for å studere sædkvalitet. Bruk av eksisterende, samt forbedring og utvikling av nye protokoller til bruk i flowcytometrisk analyse er viktig med tanke på å oppnå pålitelige data som kan brukes til å forbedre sædkvalitet. Utvikling av nye konserveringsmetoder for sæd vil i tillegg være viktig for å forbedre sædkvaliteten. SpermVital teknologien som prosesseringsmetode er utviklet med å tanke på forlenge levetiden til spermiene inni hunndyret og dermed øke sjansen for at befruktningsdyktige spermier er tilgjengelig når eggløsningen finner sted. Denne teknologien vil derfor være spesielt nyttig ved kunstig inseminasjon av husdyr. Videre analyse av sædkvalitet etter prosessering vil være essensielt for å forbedre eksisterende produkt og dermed øke fruktbarheten ytterligere.
Utplukk av spermier
Ved flowcytometrisk analyse er korrekt utplukk av spermiepopulasjon og ekskludering av debris, altså alle partikler i prøven som ikke er spermier, viktig for å oppnå pålitelige data. Sammenlikning av to instrumenter med ulike prinsipper for måling av spermienes cellestørrelse viste i denne avhandlingen at måling av elektronisk volum (EV) er en mer nøyaktig metode enn det mer brukte lysspredningsprinsippet betegnet forward scatter (FS). Til tross for god overenstemmelse mellom instrumentene som ble sammenliknet viste resultatene at bruken av proben MitoTracker Orange (MO) var nødvendig for korrekt utplukk av spermier i videre analyse ved bruk av instrument med FS prinsipp i motsetning til EV prinsippet.
Spermiefunksjonalitet og testing av ny probe
Spermiefunksjonalitet kan analyseres med flowcytometri med hensyn på mange forskjellige parametere. For å oppnå befruktning av eggcellen etterfulgt av normal embryoutvikling må spermiene være fullt kompetente. Dette betyr at membraner, organeller og DNA må være funksjonelt intakte og de må kunne ha potensiale til å gjennomgå alle biokjemiske og molekylære endringer som er nødvendige i fertiliseringsprosessen. Spermiehodet har blant annet en vesikkel, kalt akrosom, som inneholder enzymer som må frigjøres gjennom akrosomreaksjon på riktig tidspunkt for at spermien skal kunne fusjonere med egget. Spermiecellenes intracellulære kalsiumnivå er tett knyttet opp mot modningsprosessen kalt kapasitering og som er forløpet til akrosomreaksjonen og endring i bevegelsesmønsteret. Forskerne ønsket å teste om fargestoffet Cal-520 kunne brukes til å studere nivået av intracellulært kalsiumnivå, og resultatene indikerer at dette kan være en nyttig probe (fluoriserende fargestoff).
Forskjeller i parametere
I sitt doktorgradsarbeid fant Fride Berg Standerholen at det var forskjeller i utvalgte spermiefunksjonalitetsparametere mellom standard Biladyl (B) prosessert sæd og immobilisert SpermVital (SV) sæd. Resultatene viste at de to sædtypene responderte tidsmessig forskjellig når de ble inkubert i forhold som initierer kapasiteringsprosessen. Mengde intracellulær ATP i den levende spermiepopulasjonen var imidlertid høyere for SV-sæd, noe som kan forklares med at energinivået bevares bedre i immobilisert tilstand der bevegelse av spermiene hemmes og energilageret derved bevares inntil de blir frigjort ved oppløsning av gelen.
Lik fruktbarhet
I doktorgradsarbeidet ble det observert lik fruktbarhet for både SV-sæd og standard B-sæd når inseminasjon ble utført til normaltid i et feltstudie som omfattet over 14 000 inseminasjoner. Det er i utgangspunktet ikke optimalt for SV-sæd på grunn av oppløsningstiden sæden krever. Til tross for at immobiliseringsprosedyren forårsaket økt spermieskader med hensyn på plasmamembran- og akrosom-integritet, som anses som viktig for selve befruktningen, samt at inseminasjon ble utført til normal tid, ble lik fruktbarhet observert. Selv om plasmamembran- og akrosom-integritet ikke var korrelert med fertilitet i denne studien antas det allikevel at dette er en viktig kvalitetsparameter og SpermVital har derfor brukt denne kunnskapen til å forbedre SV-sæden med hensyn på disse parameterne i etterkant av feltstudien.
Resultater har praktisk betydning
Resultatene i denne avhandlingen har direkte praktisk betydning med tanke på bruk av flowcytometri som evalueringsmetode av sædkvalitet.
Fride Berg Standerholen forsvarte sin doktoravhandling «Flowcytometrisk evaluering av spermiefunksjonalitet relatert til ulike metoder for konservering av oksesæd og fertilitet» ved NMBU Veterinærhøgskolen, Institutt for produksjonsdyrmedisin 2. november.