Doktorgradsarbeidet til Trine Øye Isaksen bidrar til økt forståelse for hvordan spesifikke enzymer bidrar i mikrobiell nedbrytning av plantebasert biomasse.
Lignocellulose representerer en viktig kilde til fornybart organisk materiale og er av interesse som råmateriale for bioraffineringsindustrien, ikke bare som en lovende strategi for erstatning av fossile brensler i transportsektoren, men også for produksjon av kjemikalier og dyrefôr. Den komplekse og gjenstridige sammensetningen av lignocellulose gir store utfordringer i bioraffineringen av dette råmaterialet. Enzymatisk omdanning av polysakkaridene i lignocellulosen, spesielt cellulose, regnes som et avgjørende og utfordrende trinn i bioraffineringsprosessen. Dette trinnet representerer også en av hovedbegrensningene i overgangen til en bærekraftig bioøkonomi. For å overvinne den tungt nedbrytbare lignocellulosen har mikroorganismer utviklet intrikate enzymsystemer, som blant annet inneholder lytiske polysakkarid monooksygenaser (LPMOer). LPMOer er kobberavhengige enzymer som, i nærvær av en elektrondonor, bryter glykosidbindingene i forskjellige polysakkarider ved bruk av en oksidativ mekanisme. I synergi med cellulaser, som er hydrolytiske enzymer, øker LPMOer hastigheten til den enzymatiske nedbrytningen av cellulose. Siden oppdagelsen av LPMOer i 2010 har den katalytiske funksjonen til disse enzymene, samt deres potensiale innen nedbryting av biomasse, tiltrukket forskere fra både akademia og industri. Til tross for betydelig forskningsinnsats er kunnskapen om LPMOenes funksjon fortsatt begrenset.
Denne avhandlingen beskriver studier av de substratnedbrytende egenskapene til LPMOer, anskaffet gjennom en detaljert studie av en LPMO fra en sopp, Neurospora crassa. NcLPMO9C er et to-domene protein med et N-terminalt LPMO-domene koblet, via en linker, til et C-terminalt karbohydratbindende domene (CBM1). I forkant av studiene presentert her, hadde LPMO-aktivitet kun blitt vist for krystallinske substrater av kitin og cellulose. Artikkel I beskriver for første gang oksidativ aktivitet av en LPMO på løselige cello-oligosakkarider. Ved spaltning av cellopentaose genererer NcLPMO9C to hovedprodukter, en nativ cellotriose og en oksidert cellobiose. Ved bruk av både NMR- og MS-analyser ble det påvist at NcLPMO9C tilfører et oksygenatom til C4-karbonet på den ikke-reduserende enden av cellobiosemolekylet når enzymet spalter β-(1,4) glykosidbindingen. Artikkel II utdyper aktiviteten til NcLPMO9C mot løselige substrater. Ved bruk av glukanmikroarray screening ble det oppdaget at NcLPMO9C er aktiv på forskjellige hemicellulose substrater. Denne egenskapen ble studert videre ved å undersøke nedbrytningen av vanlig forekommende hemicellulosepolymerer. Det ble vist at NcLPMO9C kløyver β-(1,4)- glykosidbindinger i de fleste hemicelluloser med en hovedkjede av β-glukan (som forskjellige β-glukaner, glukomannan og xyloglukan) og kan tolerere forskjellige substitusjoner på hovedkjeden. NcLPMO9C virker spesielt aktiv på xyloglucan, og det ble vist at enzymet er i stand til å frigjøre oksyderte fragmenter fra xyloglukane isolert fra både Arabidopsis thaliana og Solanum lycopersicum (tomat plante).
Artikkel III beskriver krystallstrukturen for det katalytiske domenet til NcLPMO9C og ytterligere biokjemisk karakterisering av dette enzymet. Selv om ingen struktur med et bundet substrat ble oppnådd, ble innsikt i bindingsegenskapene til NcLPMO9C avledet fra isotermisk titreringskalorimetri og studier av enzymreaksjonshastigheter. Substratbindingsaffiniteten og aktiviteten til NcLPMO9C ble påvirket ved fjerning av det C-terminale CBM1-domenet for både fosforsyre-svellet cellulose (PASC) og xyloglukan. Mens bindingskonstanter for disse substratene var i det lave mikromolare området, var bindingsaffiniteten for cellohexaose meget lav, med en Kd nær 1 mM. Strukturell sammenligning av LPMO9er med kjente aktiviteter og strukturer viste at LPMOens oksidative regioselektivitet (C1-spesifikk, C4- spesifikk eller blandet spesifisitet) korrelerer med strukturelle egenskaper nær kobberbindingssetet, som tidligere også har blitt observert for bakterielle LPMOer. EPR-analyser viste for første gang at substratbinding forårsaker endringer i hvordan enzymet binder kobberatomet.
Til slutt kan det oppsummeres at studiene i avhandlingen presenterer ny innsikt i de substratnedbrytende egenskapene til LPMOer, samt de strukturelle grunnlag derav. Arbeidet bidrar også til dagens forskning som tar sikte på å forstå de katalytiske egenskapene til LPMOer og utnyttelsen av disse egenskapene i industrielle biorefiningsprosesser.