Doktorgradsarbeidet til Tina Rise Tuveng undersøker proteiner med potensiell rolle i degradering av kitin-rik biomasse.
I overgangen fra en fossil-basert til en bio-basert økonomi må bruken av fornybare ressurser utforskes. Kitin er, etter cellulose, ansett som den biomassen det fins mest av på jorden, og har mange applikasjoner innen eksempelvis medisin, jordbruk og matindustri. Ekstraksjonsprosessen av kitin fra kitin-rik biomasse og videre produksjon av kitosan og kitooligosakkarider involverer i dag farlige kjemikalier. Det er derfor ønskelig å erstatte dagens kjemiske prosess med en enzymdrevet prosess da dette vil være mer miljøvennlig.
I tillegg kan enzymer brukes til å produsere godt definerte kitosaner og kitooligosakkarider, noe som er av interesse siden bioaktiviteten til disse forbindelsene er avhengig av egenskaper slik som fraksjon av acetylering, grad av polymerisering og acetyleringsmønster. Å undersøke hvilke proteiner mikroorganismer bruker når de vokser på kitin kan gi innsikt i naturlig kitin-nedbrytning og kan gi relevante enzymer som trengs for industriell valorisering av kitin-rik biomasse.
Artikkel I beskriver karakteriseringen av en karbohydrat esterase familie 4 (CE4) deacetylase, som ble valgt på grunn av sitt potensiale for bruk i produksjon av kitooligosakkarider med definert fraksjon av acetylering og acetyleringsmønster. En god forståelse av hvordan disse enzymene interagerer med sitt substrat og enzymenes spesifisitet er viktig for å utnytte enzymene på en best mulig måte. Artikkel I inkluderer det første enzym-substrat komplekset for en CE4 med et åpent aktivt sete, og gir verdifull informasjon om hvordan dette enzymet interagerer med sitt substrat.
Et vidt spekter av karbohydrataktive enzymer kodes av genomet til Cellvibrio japonicus, inkludert flere kitinaser og andre enzymer som muligens er involvert i kitin nedbrytning. Artikkel II utforsker de proteinene C. japonicus sekreterer når den vokser på kitin. Resultatene viser at de fire glykosyl hydrolase familie 18 (GH18) kitinasene som finnes i genomet til C. japonicus produseres i store mengder, noe som indikerer at disse enzymene er involvert i nedbrytning av naturlig kitin.
Artikkel III gir en fyldigere beskrivelse av GH18 kitinasene produsert av C. japonicus. Ved å slå ut kitinasegenene, ble det vist at en av kitinasene, CjChi18D, er helt avgjørende for at bakterien skal kunne utnytte kitin som karbonkilde. Biokjemisk karakterisering viste at CjChi18D er den mest effektive i nedbrytning av kitin, som kan forklare dens avgjørende rolle. Sammenligning av de fire enzymene indikerte at de har ulike og antageligvis komplementære funksjoner, eksemplifisert med CjChi18C som har høyest aktivitet mot kitoheksaose. Transkriptomikk analyser viser at de fire GH18 kitinasene og en kitin-aktiv lytisk polysakkarid monooksygenase, CjLPMO10A, er oppregulert når C. japonicus vokser på kitin.
Serratia marcescens innehar ett av de mest studerte kitinolytiske maskineriene, som involverer tre kitinaser, en lytisk polysakkarid monooksygenase og en kitobiase. Genomet til en av de best studerte S. marcescens familiene hadde imidlertid ikke blitt sekvensert da arbeidet med denne avhandlingen startet, og viktigheten av eventuelt andre proteiner i kitin-nedbrytningen hadde ikke blitt undersøkt. Dataene presentert i Artikkel IV inkluderer genomsekvensen til S. marcescens BJL200 og en proteomikk-basert undersøkelse av hvilke proteiner som sekreteres når bakterien vokser på kitin. Genomsekvensen viste at genomet inneholder en fjerde kitinase, SmChiD. Proteomikk og biokjemisk karakterisering av SmChiD antyder at dette enzymet ikke er viktig i kitin-nedbrytning, og en annen, hittil ukjent, biologisk rolle for denne kitinasen antas.
Oppsummert så gir dataene presentert i avhandlingen innsikt i kitinaktive enzymer produsert av bakterier. Artikkel I gir verdifull innsikt i hvordan CE4 deacetylaser med et åpent aktivt sete binder sitt substrat. Artikkel II-IV bekrefter at kitinaktive enzymer, spesielt hydrolaser, har viktige roller i naturlig nedbrytning av kitin. I tillegg gir Artikkel II-IV en liste med proteiner uten en åpenbar rolle i kitin-nedbrytning. Disse proteinene blir dratt frem som mulig mål for videre undersøkelse av deres potensielle rolle i nedbrytning av kitin-rik biomasse.
Tina Rise Tuveng disputerer ved NMBU 10. november 2017.
Fakta
